Материалы и методы исследования

одноразовые наконечники до 1000 мкл;

штатив для пробирок 0,5 мл (или 0,2 мл) «рабочее место»;

агароза, раствор бромистого этидия, 50хТАЕ буфер для приготовления геля и проведения электрофореза (или готовый комплект реагентов для электрофоретической детекции);

пластиковая емкость большого объема для дезактивации буфера и гелей.

СОСТАВ НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ для ПЦР

В состав набора реагентов входят три комплекта:

. Комплект для пробоподготовки (выделения ДНК)

«Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ» (кат № 020104) (на 50 образцов):

. Лизирующий раствор 5 мл

. Раствор I 25 мл

. Раствор II 10 мл

. Раствор III 100 мл

. Cорбент 1 мл

. ТЕ буфер 2.5 мл

Комплекты для проведения ПЦР (амплификации).

Рассчитаны на проведение анализа 50 исследуемых образцов, 5 положительных контрольных образцов и 5 отрицательных контрольных образцов.

ХЕЛИКОПОЛ (кат № 010111):

Реакционная смесь 150 мкл полимераза (5 ед/мкл) 15 мкл

Разбавитель 1 мл

Минеральное масло 1 мл

ДНК контрольная H.pylori 25 мкл

. Комплект для детекции продуктов амплификации

Для детекции продуктов амплификации можно использовать как готовые комплекты, так и отдельные реагенты.

Готовые комплекты:

Комплект №1 (кат №030106) (на 100 -150 образцов)

агароза-2х2г, 50хТАЕ буфер-25 мл, раствор бромистого этидия-30мкл

Комплект №2 (кат №030107) (на 120 образцов)

% агарозный гель (40 лунок) - 3 шт, 50хТАЕ буфер-25 мл

Отдельные реагенты:

Агароза (100г/уп; 2г/уп) (кат №030101)

Раствор бромистого этидия (1мл/уп) (кат №030104)

50хТАЕ буфер (200 мл/уп; 120мл/уп) (кат №030102)

2% агарозный гель для электрофореза (40 лунок) (1шт/уп; 5шт/уп) (кат №030108).

Проведение исследования

Взятие, доставка и хранение материала:

Исследуемый биопсийный материал опускается в стерильную сухую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.

Пробу доставить в лабораторию в течение 2-х часов (в термосе со льдом) для выделения ДНК или заморозить и хранить при температуре - 20°C не более 2 недель.

Выделение ДНК из биопроб:

. В 1.5 мл пробирку с биоптатом добавить 100 мкл лизирующего раствора и инкубировать, периодически встряхивая, при 55оС до полного растворения ткани (это процесс занимает от 2 до 4 часов , при необходимости инкубацию можно проводить в течение ночи при 37оС).

. Осадить сконденсированные на внутренней поверхности пробирки капли жидкости центрифугированием в течение 5 сек при 8-12 тыс. об/мин. К полученному лизату добавить 20 мкл суспензии сорбента (перед добавлением суспензию тщательно перемешать) и 500 мкл раствора I . (Раствор I перед использованием прогреть на водяной бане 10 мин. при температуре 50-60оС и тщательно перемешать). Полученный раствор перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин., периодически встряхивая на вортексе.

. Осадить сорбент центрифугированием на микроцентрифуге в течение 15 сек при 8-12 тыс. об/мин. Удалить супернатант.

На всех стадиях обработки клинического материала удаление супернатанта производят одноразовыми пластиковыми наконечниками при помощи вакуумного насоса в колбу-ловушку, содержащую дезинфицирующий раствор (3% хлорамин или 5% перекись водорода и т.п.)

. К осадку добавить 200 мкл раствора II, перемешать смесь, осадить сорбент центрифугированием в течение 15 сек на микроцентрифуге при 8-12 тыс. об/мин., удалить супернатант.

. Промыть сорбент 2 раза 1 мл раствора III , как описано в п.2.4

. Пробирки поместить в твердотельный термостат и подсушить сорбент 5-10 мин при температуре 55-60оС, оставляя пробирки открытыми.

. В пробирки с сорбентом добавить 50 мкл ТЕ буфера, закрыть их, тщательно перемешать на вортексе и инкубировать в течение 5 минут при 55-60оС.

. Пробирки центрифугировать 15 сек при 8-12 тыс.об/мин

Водную фазу (супернатант) использовать в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации.

Водную фазу снятую с сорбента можно хранить при температуре -20оС в течение 6 месяцев.

Проведение ПЦР (амплификация):

. Приготовить и пронумеровать пробирки для проведения амплификации вместимостью 0,5 мл (или 0,2 мл), включая пробирки для положительных и отрицательного контрольных образцов

. За 20-30 минут до приготовления амплификационной смеси извлечь комплект реагентов для амплификации из морозильника, разморозить содержимое (желательно поместить пробирку с Taq-полимеразой в ледяную баню). Размороженные пробирки тщательно встряхнуть для перемешивания содержимого.

. Из компонентов набора приготовить смесь реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу:

ХЕЛИКОПОЛ:

Разбавитель17,5 мкл,

Реакционная смесь32,5 мкл,полимераза0,2мкл

Рекомендуется готовить смесь реагентов не менее чем на 5 реакций для достоверной дозировки объема фермента

Для каждой смеси праймеров готовится отдельная амплификационная смесь. Все компоненты добавлять отдельными наконечниками.

. После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пипетированием.